1. Введение

Суставной хрящ — это аваскулярный гиалиновый хрящ с медленным метаболизмом. Восстановление хряща, поврежденного в результате травмы или дегенерации представляет собой непростую клиническую задачу. В настоящее время разработаны несколько программ для лечения дегенеративных изменений хряща, каждая из которых имеет свои достоинства и недостатки. Микрофактуринг просто выполним технически и эффективен, но, как было неоднократно показано, влечет за собой образование фиброзной, волокнистой хрящевой ткани, особенно в случае больших поражений. Имплантация аутологичных хондроцитов является золотым стандартом, но требует значительных денежных затрат, времени, артротомии и проводится в две стадии. В последние годы проводились исследования, которые показали успешность применения очищенных коллагеновых гелей 1 типа одновременно со стимуляцией костного мозга для лечения суставных заболеваний. Ателоколлаген получают последовательной обработкой дермы пепсином и удалением телопептида. Такая обработка придает препарату иммунонейтральный статус и сохраняет свойства природного нерастворимого коллагена, что делает препарат идеальным средством для регенерации ткани.

2. Хондрогенная дифференциация мезенхимальных стволовых клеток в смеси фибрина и ателоколлагена.

2.1. Мезенхимальные стволовые клетки человека (МСКЧ), полученные из костного мозга при втором высевании, культивировали с последующим двухкратным высеванием в Promocell MSC среде в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Если не оговаривались специальные условия, среда для пролиферации и последующего пассажирования содержала модифицированную среду Dulbecco modified Eagle с низким содержанием глюкозы, 20% эмбриональный серум быка, 100 Ед/мл пенициллина, 100 микрограмм/мл стрептомицина. Клеточные культуры инкубировали при 37С в атмосфере, насыщенной 5% СО2. По завершении инкубации клетки промывали соляным раствором и отделяли от субкультуры 0.25% трипсином с ЭДТА. Полученные МСКЧ использовали для последующих процедур.

2.2. Инкапсулирование МСКЧ в коллаген.

Мезенхимальные стволовые клетки в финальной концентрации 1х106 смешивали с раствором ателоколлагена свиньи тип 1. Смесь наносили на стерильные чашки Петри (Рис.1) и инкубировали при комнатной температуре 45 минут до затвердевания коллагена. Коллагеновые шарики отделяли от поверхности чашек в теплую культуральную среду, собирали в 50 мл пластиковые центрифужные конические пробирки. Каждая капля объемом 60 микролитров содержала 100 000 клеток.

Среду для пролиферации добавляли в каждую пробирку и инкубировали 2 дня в атмосфере 5% СО2 при 37º С так, чтобы дать клеткам возможность приспособиться к среде. Коллагеновые шарики делили на 2 группы: контрольную и экспериментальную — дифференциация хондорогенов. Шарики из контрольной группы инкубировали в культуральной среде, в то время как шарики из экспериментальной группы инкубировали в среде хондрогенной дифферецировки в течение всего периода. Культуральная жидкость для хондрогенной дифференцировки содержала модифицированную Dulbecco Eagle среду с высоким содержанием глюкозы, 10 нг/мл фактор роста бета 3 ( TGF-beta 3), 25 микрограмм/мл аскорбиновую кислоту, 25 микроМ аскорбиновую кислоту-2-фосфат, 100 Ед/мл пенициллина, 100 микрог/мл стрептомицина и 1% об ITS. Культуральную жидкость меняли 2 раза неделю в течение 3 недель.

2.3. Анализ хондрогенной дифференциации.

Гелевые шарики с МСКЧ отделяли от культуральной жидкости двухкратным промыванием и затем инкубировали в атмосфере 5% СО2. Содержание гликозаминогликана определяли с использованием раствора сафранина в воде (10мг/мл). Затем образцы промывали дистиллированной водой и 3% уксусной кислотой и окрашивали раствором толуидина голубого в течение 12 часов при комнатной температуре.

Рис.1 (а) Нанесение смеси ателоколлагена и фибрина на чашки Петри (b) Гелеобразование

Рис.1 (а) Нанесение смеси ателоколлагена и фибрина на чашки Петри (b) Гелеобразование

Рис.2 Анализ хондрогенной дифференцировки. Окрашивание О-сафранином (а) и толуидином (b).

Рис.2 Анализ хондрогенной дифференцировки. Окрашивание О-сафранином (а) и толуидином (b).

2.4. Микроструктура коллагеновых шариков с МСКЧ.

Сканирующая и трансмиссионная электронная микроскопия были использованы для анализа морфологии коллагеновых шариков, содержащих МСКЧ. Коротко: шарики фиксировали в смеси 4% параформальдегида и 2.5% глутарового альдегида в 0.1М фосфатном буфере и затем фиксировали в 1% тетраоксиде осмия в том же буфере в течение часа. Затем шарики обезвоживали последовательно этанолом и ацетоном и наносили на эпоксидную смолу Epon 812 для сканирования. Ультатонкие срезы выполнялись микротомом и окрашивались уранилацетатом и цитратом свинца и исследовались сканирующим и трансмиссионным микроскопом.

2.5. Распределение клеток и определение их жизнеспособности.

induz3

Рис.3. Сканирующая (a) и трансмиссионная (b) электронная микроскопия коллагеновых шариков. На микрофотографии шариков, содержащих МСКЧ в условиях хондрогенной дифференциации (b), видны волокна коллагена, синтезированного de novo.

Жизнеспособные клетки определяли на срезах флуоресцентным микроскопом. Делали срезы толщиной 10 мм и инкубировали их в пролиферационной среде, содержащей 2микроМ ацетоксиметил калцеин (флуресцин). Методы регенеративной медицины в восстановлении поврежденной ткани основаны на использовании внеклеточного матрикса, очищенного от клеток. В публикации описан клинические и радиологические результаты 4-х летнего опыта использования внеклеточного матрикса. Описана одноступенчатая технология микросверления и имплантации бесклеточного ателоколлагена в гелевой форме. В результате имплантации происходит рост гиалинового хряща с минимальной морбидностью.

3. Материалы и методы.

3.1. Пациенты.

Возраст: 18-65 лет.

Повреждения III/IV стадии по классификации ICRS/Outerbridge, 2-8 см2

Все пациенты были проинформированы и дали согласие на операцию.

Исключение составили пациенты с вальгусной или варусной деформацией (5 град) и генералированным остеоартритом.

Рис.4. Биохимическое окрашивание срезов коллагеновых шариков. Окрашивание флуоресцентным красителем после 4-х дневной инкубации. Жизнеспособные клетки имеют зеленую окраску, нежизнеспособные – красную. Окрашивание проводили ацетоксиметил калцеином и гомодимером этидия.

Рис.4. Биохимическое окрашивание срезов коллагеновых шариков. Окрашивание флуоресцентным красителем после 4-х дневной инкубации. Жизнеспособные клетки имеют зеленую окраску, нежизнеспособные – красную. Окрашивание проводили ацетоксиметил калцеином и гомодимером этидия.

3.2. Техника операции.

Операция проходила под общей анестезией. Для доступа к суставу использовали стандартные антеролатеральные и антеромедиальные артроскопические порталы. Операция проводилась под физраствором (давление, равное систолическому). После оценки дегенерации был проведен дебридмент повреждения с помощью кюретки и лезвия. Микросверление осуществляли, используя уголовое сверло (угол 45º). Отверстия сверлили глубиной 6 мм на расстоянии 3 мм. Вторая часть операции осуществлялась в сухих условиях при подаче СО2. Углекислый газ подавали под давлением 20 мм. рт. ст. при скорости потока 20 л/мин через канюлю Вольфа через суперолатеральный портал. Остатки физраствора удаляли из сустава аспирацией 20 мл шприцем и угловой трубкой. Повреждения высушивали ватными тампонами, которые вводили через пластиковые трубки. Для подъема колена и дальнейшего открытия сустава использовали коленный зажим или зажим Lewin. Инъекцию осуществляли двумя 1-мл шприцами и Y-образным катетером, соединенным с иглой (размер 20, внутренний диаметр 0.9 мм, длина 90 мм). Другой шприц наполняли ателоколлагеном (0.9 мл) и тромбином (0.1мл). Иглу вводили через портал, наиболее подходящий для доступа к повреждению. Под контролем артроскопической камеры вводили гель. Давление углекислого газа и адгезивные свойства геля обеспечивали легкость введения материала против гравитации. Гель вводили послойно с интервалом 1-2 мин до полного заполнения сустава. Время застывания геля составляет 5 минут, и затем слой выравнивали in situ используя диссектор МасДональда. По окончании процедуры прекращали подачу углекислого газа и вдували физраствор. Стабильность транспланта обеспечивали выполнением нескольких циклов сгибательно-разгибательных движений. Рану послойно ушивали.

Рис.5. ACIC артроскопия. (а) микродриллинг, (b) инъекция фибриново-коллагеновой смеси, (с) прикрепление фибриново-коллагенового геля, (d) повторная артроскопия через год.

Рис.5. ACIC артроскопия. (а) микродриллинг, (b) инъекция фибриново-коллагеновой смеси, (с) прикрепление фибриново-коллагенового геля, (d) повторная артроскопия через год.

Рис.6. Установка артроскопических порталов

Рис.6. Установка артроскопических порталов

Рис.7. Подготовка инъекции двумя 1-мл шприцами с ателоколлагеном (0.9 мл) и тромбином (0.1мл).

Рис.7. Подготовка инъекции двумя 1-мл шприцами с ателоколлагеном (0.9 мл) и тромбином (0.1мл).

3.3. Реабилитация

Все пациенты проходили стандартную программу реабилитации (CPM) сразу после операции. Полная нагрузка на ногу была показана через 6 недель после процедуры. Для Пациентов с пателло-феморальными повреждениями сгибания в суставе были ограничены до 20º в течение первых 2 недель, и постепенно увеличивались до 90º в течение последующих 6 недель. Спортивные нагрузки были рекомендованы через 9-12 месяцев.

3.4. Оценка.

Улучшения клинической картины оценивали по шкале Lysholm, IKDC, KOOS. Состояние суставов у все пациентов оценивали при помощи МРТ (1.5 — 3 Т) с использованием спин-эхо и double-echo протоколов до и после операции. Структурные особенности повреждений до и после операции были охарактеризованы по шкале MOCART, от 0 до 100 пунктов. При этом за 0 пунктов принимали наихудший результат, за 100 — наилучший. Количественную оценку восстановления ткани проводили Т2 картированием и методом d-GEMRIC на этапе 12 и 18 месяцев.

4. Результаты.

В исследовании принимали участие 30 пациентов. Повреждения были локализованы в медиальном и латеральном мыщелках (MFC, LFC), надколенниках или коленной чашечке размер повреждения составлял от 2 до 8 см2. В течение последующих 4 лет показатели по шкале Lysholm изменились с 50.8 до операции до 80.4 после операции. Показатель KOOS (симтоматика) изменился с 64.7 до операции до 88.2 после операции. Показатель IKDC — от 39 до 78.6 соответсвенно до и после операции. Среднее значение показателя MOCART составляло 72. Среднее значение времени релаксации Т2 для восстановленной ткани и нативного хряща составили 26.4 и 29.9 соответственно.

Рис.8. Результаты предоперационного МРТ сустава 60-ти летней женщины с повреждением хрящевой ткани правого бедренного мыщелка (а и с). Стрелками показаны места повреждения. b и d – МРТ через год после операции. Стрелками показано восстановление поврежденной ткани.

Рис.8. Результаты предоперационного МРТ сустава 60-ти летней женщины с повреждением хрящевой ткани правого бедренного мыщелка (а и с). Стрелками показаны места повреждения. b и d – МРТ через год после операции. Стрелками показано восстановление поврежденной ткани.

Рис.9. Т2-картирование. Значения Т2 показателей одинаковы для восстановленной ткани и нативного хряща (36±6 ms).

Рис.9. Т2-картирование. Значения Т2 показателей одинаковы для восстановленной ткани и нативного хряща (36±6 ms).

5. Обсуждение

Впервые метод восстановления хряща с применением ателоколлагенового геля и нагнетанием диоксида углерода был опубликован в 2013 году. Авторы сообщали о хороших клинических результатах в период 2 лет после операции. Подобная методика с успехом применялась и в других центрах. Метод, описанный в данной публикации, отличается нагнетанием вместо воздуха диоксида углерода, который уже давно используется в эндоскопических операциях и, как доказано на экспериментах с животными, не оказывает неблагоприятного воздействия на организм.

Методы по восстановлению суставного хряща обычно основаны на применении коллагеновых мембран, которые внедряются непосредственно в поврежденный сустав. В этом случае поврежденное место должно располагаться достаточно глубоко, чтобы обеспечить возможность должным образом укрепить мембрану. При поверхностных повреждениях мембрану приходиться пришивать. Состав, содержащий ателоколлаген и фибрин, застывает в гель и тем самым заполняет пространство вокруг поверхностного повреждения. Коллаген — это белок, который составляет основу соединительной ткани и обеспечивает ее морфологию. Ателоколлаген — это фракция коллагена (обработка пепсином) из кожи свиньи, которая не содержит телопептид, обладающий иммуноактивными компонентами. Очищенный иммунонейтральный коллаген используют при протезировании сосудов, замене костной ткани и гемостазе.

Авторы публикации не советуют использовать сверла большого диаметра при выполнении дебридмента. Напротив, природный суставной хрящ может быть сохранен, деградированную часть лучше выскабливать кюреткой или лезвием. Для описываемой техники форма повреждения не имеет значения, так как коллагеново-фибриновый гель заполняет любую форму. Главное осторожно удалить субхондральную склеротическую часть без повреждения всей субхондральной пластины.
После введения коллаген-фибриновой смеси она застывает в гель в течение 5 минут благодаря реакции между фибриногеном и тромбином, которая начинается при смешивании компонентов уже при наполнении шприца. В дополнение имплант приобретает нужную форму после выполнения ряда сгибательных/разгибательных движений.
Chen с коллегами показали, что микродриллинг имеет ряд преимуществ перед микрофрактурингом поскольку он формирует каналы для стромы костного мозга и облегчает использование стволовых клеток. Каналы также увеличивают адгезию транспланта и вращательную устойчивость во время движения.
Описанный метод продемонстрировал положительные результаты в период 4 последующих лет, что выражалось в росте хрящевой ткани на основании показателей МРТ и шкалы MOCART. Количественное МРТ с Т2-картированием и d-GEMRIC сканирование хрящевой ткани показало восстановление ткани.

6. Заключение

Описан эффективный артроскопический метод регенерации хрящевой ткани с применением микродриллинга в сочетании с коллаген-фибриновым гелем.